如果用生长活跃的菌株染色，老化的革兰氏阳性菌会被染成红色，造成假阴性。涂片不能太厚，以免脱色不完全造成假阳性。脱色是革兰氏染色成功的关键。脱色不足导致假阳性，脱色过度导致假阴性。
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1.选择生长期活跃的菌株进行染色，老化的革兰氏阳性菌会被染成红色，造成假阴性。
2.涂片不能太厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3.脱色是革兰氏染色成功的关键。脱色不足导致假阳性，脱色过度导致假阴性。
实验流程
1.取玻片，用纱布擦干。用记号笔在载玻片的一侧画一个小圆圈(用来大致确定细菌液滴的位置)。在火焰上烘烤有涂层的部分以去除油脂。
2.诽谤
液体培养基：左手拿着菌液试管，打开酒精灯火焰附近约5cm的管盖；右手拿着接种环，在火焰中燃烧灭菌。冷却后，从试管中蘸取一圈菌液，在干净无脂的载玻片上涂上一层直径约2mm的薄膜，最后将接种圈在火焰中灼烧灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，然后用接种环取少量细菌，涂在载玻片上，使之变薄、均匀。
3.干燥：让涂片在空气中自然干燥。
4.固定：使菌膜朝上，用火焰固定2-3次(以不烫手为宜)。
5.染色：将固定后的涂片放在报纸上，滴草酸铵结晶紫，染色1分钟。
6.冲洗：用水慢慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色后可观察到细胞形态。
7.媒染：滴1滴碘溶液，染色1分钟，水洗。
8.脱色：吸收残留水，连续加入95%乙醇脱色20-30秒，直至流出液无紫色，立即用水冲洗。
9.复染：滴加范宏复染3-5分钟，用水冲洗。至此，革兰氏染色完成。