有问题就有答案
原癌基因激活的机制有哪些
1）、点突变原癌基因的产物通能促进细胞的生长和,点突变的结果使基因产物的活性显著提高,对细胞增殖的刺激也增强,从而导致癌症.2)、DNA重排原癌基因在正常情况下表达水平较低,但当发生染色体的易位时,处于活跃转...
阳性克隆标记有哪些
基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1 根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发 行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号 (accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有:(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上 地址为为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其 网上地址为和 TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以 Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过 Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序 列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩 增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋 白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
2 根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下 来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针 杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节省时间。
3 未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。
3． 1 随机引物法克隆未知序列基因［1］ 随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或RNA 的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生 物体发生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体 所表达的基因很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同表型但又很类似的 基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生 物个体之间没有比较意义(见图1)。
图1 应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物
AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度(annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采 用较高的退火温度扩增。AP-PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的 强度,可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步 工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测到的特定片段从凝胶中切下, 提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引物长度多在 20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。根据接头的 序列扩增。
图2 含有AP-PCR产物的特定基因的扩增与克隆
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT- PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly (A)尾部序列,根据poly (A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为12类(见图3)。根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种 cDNA分别做模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于 2种种源近似生物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点 是快速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广泛应用于 生物表型相关基因的克隆及比较研究。
图3 真核生物12种mRNA的序列特点
图4 DD-PCR示意图 箭头所示为特异扩增产物
3.3 Representative difference analysis PCR (RDA-PCR)［3～5］ 这 是一种差减杂交 (subtractive hybridizatio-n)与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR和DD-PCR。前2种方法是将 两模板DNA或cDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带,其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再扩 增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将 靶基因组中所有共同的基因掩盖起来,而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。其操作程序为:(1)用同一限制性内切酶(一般用Bam HI,Bgl II或Hind III)同时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基因组DNA的量；(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接 头,其序列与酶切产生的粘性末端的序列相对应；(3)将2个基因组的DNA混合后,高温变性,低温退火。由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA 量,那么与掩盖基因组DNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因的影响；(4)用Taq DNA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应的引物,经过30个左右的PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。这种方法 的起始操作程序较复杂,各反应步骤要求准确无误,但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。
图5 RDA-PCR示意图
4 用特异抗体克隆基因
用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克隆抗体最为理 想。获取特异抗体的方法主要有:(1)制备识别功能抗原的单克隆抗体;(2)将SDS-PAGE分离的蛋白质特异带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白 质;(3)用Western-blot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA 文库,从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。
5 特异基因的功能克隆
它是借助于基 因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。基因的功能克隆主要有2种:一是phage display［6，7］,另一是 peptide display。后者的原理与前者基本相同。目前以phage display的应用最为广泛,本文只对这一方法加以介绍。
任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程中,病原体本身的蛋白质成分(ligand)需要首先与宿主细胞上的受体 (receptor)相互识别连接。如病毒需要借助于受体细胞上的Heparan sulfate受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫 裂殖子需借助于宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用成分的特性与功能分析,是制订免疫预防措施及制备阻 断药物的前提。phage display法是克隆病原体ligand的一种最为理想的手段。
图6 phage display克隆基因示意图
Phage display的基本操作过程为:(1)提取某一病原体基因组DNA,用超声波将DNA切割成500～1 500的片段;(2)将片段末端用T4DNA聚合酶处理后,与载体DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅助噬菌体(helper phage)同时转染大肠杆菌。phagemid在大肠杆菌内包装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入的外源基因片段表达,表达产物主要集中在噬菌体颗粒的 表面；(3)将特定的受体固定于载体上(多为ELISA板),方法同一般的ELISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后,加入平板孔内,感作一段时间,用 PBS等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合,那些表达非相关蛋白的噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱; (4)用高强度NaCl液将结合在受体上的噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌,便可将编码特异功能蛋白质的基因克隆。
一个真核生物至少 含有10万个不同的基因,其中只有10%～15%的基因在不同的发育时期表达,且不同的基因表达的强度相差甚远。在致病生物中,致病力强的生物,其致病因 子(往往是1种或几种功能蛋白或酶)的表达量往往多于致病力弱的生物。从基因组中将人们感兴趣的基因或其转录产物扩增并克隆出来,是进一步对所编码蛋白质 作功能分析的关键。本文介绍的几种基因克隆的方法是近几年应用比较广泛的方法。在具体实验中选择哪一种方法,还要根据研究者所要克隆的基因及其所在的基因 组和对该基因的研究背景来决定。
端粒的复制为什么越来越短,DNA复制后端粒的数目变化
发布时间：2020-07-09 23:00:30
细胞在到一定程度就开始死亡，为什么癌细胞就可以无限
世界上最著名的癌细胞—海拉细胞，如今已经繁殖18000代，总重量甚至达到了5000万吨。癌组织的增殖能力十分强悍，但不代表癌细胞不会死亡，靠癌永生代价会非常高。目前世界上存在最久、繁殖数量最多的是海拉细胞，这是美国1950年代取自宫颈癌患者海拉宫颈上的细胞，如今借助体外培养技术，海拉细胞已经繁殖了18000代，总重量超过了5000万吨（没错，就是这么多），曾经被分配给全球各地的生物实验室用于研究癌细胞的增生机理以及相应的治疗方法。海拉细胞相较于其它细胞系，增殖异常迅速，大约24小时增加一代，所以如今海拉系细胞的量才那么大。不过单个的海拉细胞仍会死亡，不可能永久无限地增殖。一些人认为海拉细胞不会衰老，因而能够增殖那么多。后续的研究表明，癌细胞的无限增殖是因为细胞端粒的变化，在细胞时端粒不缩短，因此癌细胞相对拥有更强的增殖能力。然而追溯癌组织在人体内无限增殖的能力，发现癌细胞其实也受免疫系统的影响，但是它们却脱离了人体正常的细胞程序。正常的体细胞的端粒在时会缩短，基因受到的损伤也能被免疫等系统检测到，细胞有正常的衰老死亡，而当细胞功能歪曲时就会触发人体的细胞凋亡程序，最后靠巨噬细胞等吞噬异常的细胞。而癌细胞却脱离了这样的程序，基因的突变使单个细胞寿命增加，增殖迅速，短时间内会产生大量的癌细胞，而最初人体免疫却能监视这些变化，免疫系统不断地杀死那些能够识别的癌细胞，癌细胞在增殖时仍会突变，最终癌细胞脱离了人体正常的细胞程序，导致癌组织可以在人体内相对无限地增殖。所以，控制癌细胞使人永生的想法不可能实现。癌细胞本身就脱离了人体正常的调控程序，它们根本不听人体的指挥，又何来控制住癌细胞一说？每一类的癌症中，不同人类个体癌细胞也存在一定的差异，只不过其侵袭、转移的规律是一样的，因此癌细胞相当于在人体内进化来的新物种，它们存在的目的很简单，就是将基因继续传递下去，这就导致癌组织不断地增殖，也因为缺乏和人类共同进化的历史，因而癌组织没能产生和人体共存的能力，只知道不停地增殖。在人体内，有一些癌症比如甲状腺癌被称为懒癌，是一类分化程度比较高，长期存在对人体影响不是特别大的癌症，很多时候是人偶然发现脖子里有肿块才发现的，可数年维持大小不怎么增长，早期的甲状腺癌90%可以通过手术治疗，女性的5年生存率是92.8%，男性是75.4%，不过由于癌组织和甲状腺的切除以及周围淋巴的清扫，癌症治愈后可能仍需要结合放化疗、内分泌治疗，但整体上甲状腺癌的治愈率已经比较可观了；不过细胞分化程度越低，集装腺癌复发和致命的几率越高。总之，想要永生大概要想其它的办法，正常的细胞和癌细胞基因不同，具有不同的增殖规律，若人体细胞全部变成癌细胞，即便人体仍能维持体型外观（大概需要细胞不断地脱落），因为癌细胞增殖迅速，所需要消耗的物质和能量也相当庞大，很多患者都是被晚期多发转移的癌从营养上拖垮，加上转移造成的多器官衰竭死亡。若全身都是癌细胞，一天到晚只剩下吃这一件事，还干不干别的了？
基因突变和基因变异有区别吗
基因重组：两种不同的基因组合在一起，形成新的基因片段。基因突变：基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。 详细区别如下：（1）基因重组是由于不同DNA 链的断裂和连接而产生DN段的交换和重新组合，形成新DNA分子 的过程。 发生在生物体内基因的交换或重新组合。包括同源重组 、位点特异性重组 、转座作用和异常重组 四大类。是生物遗传变异 的一种机制。 指整段DNA在细胞 内或细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，并能在新的位置上复制、转录和翻译。在进化、繁殖 、病毒感染、基因表达 以致癌基因激活等过程中，基因重组都起重要作用。基因重组也归类为自然突变现象。基因工程 是在试管内按人为的设计实施基因重组的技术，也称为重组DNA。 有目的的将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不状的个体细胞内DNA分子，使之发生遗传变异的过程。来自供体的目的基因被转入受体细菌 后，可进行基因产物 的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品，如胰岛素 、干扰素、乙型肝炎疫苗 等是通过以相应基因与大肠杆菌或酵母菌 的基因重组而大量生产的。即基因重组 ！（2）基因突变（gene mutation）是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变，就叫做基因突变。1个基因内部可以遗传的结构的改变。又称为点突变，通常可引起一定的表型变化。广义的突变包括染色体畸变。狭义的突变专指点突变。实际上畸变和点突变的界限并不明确，特别是微细的畸变更是如此。野生型基因通过突变成为突变型基因。突变型一词既指突变基因，也指具有这一突变基因的个体。 基因突变通常发生在DNA复制时期，即细胞间期，包括有丝间期和减数间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义。基因突变为遗传学研究提供突变型，为育种工作提供素材，所以它还有科学研究和生产上的实际意义。